通过体外转录（IVT）获得的mRNA反应混合物中，除了所需的mRNA产物外，还存在蛋白质（如T7 RNA聚合酶和无机焦磷酸酶）、NTP、模板DNA、盐离子、各类添加剂以及IVT过程中形成的mRNA副产物（如双链RNA和截断RNA片段）等杂质。这些杂质的存在可能会对mRNA的功能产生不利影响，例如影响mRNA的准确量测、降低其翻译效率或改变免疫原性。因此，针对IVT混合物中的目标mRNA进行纯化是十分必要的，以确保其纯度和完整性，从而保障mRNA疫苗的安全性和有效性。

常见的mRNA纯化方法包括氯化锂（LiCl）沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化及层析纯化等。其中，沉淀法、磁珠法和硅胶柱法操作简单且迅速，但由于纯化效率有限，通常用于科研及早期应用场合；而在工业化生产中，层析纯化成为主要的纯化方案。

氯化锂（LiCl）沉淀法

氯化锂沉淀法是一种传统的mRNA纯化技术，利用锂离子在特定pH环境下能够减少RNA分子间的同电性排斥。形成的RNA沉淀通过离心法分离出来，获得较纯净的RNA样品。然而，工业生产中，残留的锂盐可能具有毒性，且该方法通常需在低温下进行，从而增加了能源成本和设备要求。该方法对小于100-200nt的RNA片段以及浓度较低的溶液效果不佳，推荐用于300nt以上或浓度超过400µg/ml的RNA样品，且需仔细观察沉淀后的样品是否完全溶解。

硫酸铵沉淀法

2024年1月，中科院过程工程研究所的研究表明，硫酸铵沉淀法在室温下可以高效纯化mRNA。当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%，且在室温下快速溶解的能力达到90%以上。研究结果显示，对于纯度和溶解率的最佳条件，推荐使用2M硫酸铵、pH 7.0、20℃和沉淀时间2小时，可实现近100%的沉淀率。

硅胶柱膜纯化

硅胶柱膜纯化基于硅胶膜表面对mRNA分子的亲和作用，在高盐环境中可以有效中和mRNA的负电荷。由于硅胶膜对其他杂质如蛋白质和脂类的低吸附性，能在高速离心中有效地分离mRNA与杂质。这种方法不仅高效且安全环保，因此在实验室和早期研究阶段被广泛应用。

磁珠法

磁珠法利用经过修饰的磁珠颗粒与mRNA结合，并在磁场作用下实现分离。与氯化锂沉淀法相比，这种方法能更有效地去除多种杂质。然而，磁珠的疏水作用可能对mRNA的完整性产生不利影响，需在使用中注意避免高温和过度干燥等问题。

层析法

目前，工业级纯化主要依靠层析法，以确保mRNA的高品质和高产量。Oligo(dT)亲和色谱作为主流方法，结合其他疏水层析和阴离子层析技术，可以精确分离mRNA与杂质。具体操作采用“高盐结合，低盐洗脱”的策略，可获得超过90%的纯度和收率。

在工业应用中，918博天堂提供一整套mRNA纯化技术，包括TFF层析流程及后续的蛋白酶K处理，可以高效去除与核酸结合的杂质。蛋白酶K作为广谱丝氨酸蛋白酶，对蛋白质去除效果显著。需要注意的是，918博天堂在应用中会优化蛋白酶K的添加量，以不会影响mRNA的完整性为前提，确保产品的安全与有效性。

通过自主开发的mRNA纯化工艺，918博天堂能够为客户提供工业级的mRNA原液定制化生产服务。在过去的项目中，我们成功提高了客户的mRNA原液完整度，同时显著降低了蛋白残留。这些服务使得客户在新药开发、疫苗研制等领域能够高效推进。

总之，918博天堂提供的mRNA纯化解决方案，结合高效的纯化技术与灵活的服务，助力生物医药领域的快速发展。